布鲁克·道尔顿执行副总裁Rohan Thakur博士专栏综述

MALDI质谱检测技术加速药物研发进程

寻找具有良好治疗应用前景的新候选药物方法

Rohan Thakur, Ph.D.

   在过去的几十年中，基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）已经在许多应用中证明了其有效性和稳定性。zui近MALDI-MS方面的创新促进了两种检测方案的发展，这两种方法可以用于加速临床前药物的发现：一种用于药物超高通量筛选(uHTS)技术，另一种用于药物分布研究的MALDI质谱成像技术(MALDI-MSI)。

       新药研发的一贯原则 – 失败越早，成本越低（fail early, fail cheap）– 这会驱使制药公司在早期新药发现过程中会选择尽量多的化合物去“命中”，同时会在药物的ADME/TOX(吸收、分布、代谢、排泄/毒性)的研究中快速淘汰不适合的候选药物。新举措无疑推动了药物研发管道的增长，2015-2016年其增长率达到了11.5%。¹

* 超高通量药物筛选

       小分子药物研发的理想分析工具要具有无标记的表征以及直接的检测与定量能力。快速、、易用、低成本和自动化样品制备也是大多数研发工作者对仪器的期待。新一代质谱方法本质上符合了以上多项标准，在过去几年中也为MALDI-MS使用开辟了一个新的领域。 MALDI-MS正在帮助研究人员确定zui有前景的小分子，并正在扩展到药学领域所依赖的超高通量复合筛选项目。

　　超高通量筛选（uHTS）采用Bruker的rapifleX MALDI-PharmaPulse^TM解决方案，比传统仪器快50倍，具有更高的稳定性、灵敏度和更大的质量范围。在2016年的ASMS会议上，Peter Marshall博士（葛兰素史克公司，英国）等人通过墙报描述了他们使用MALDI-PharmaPulse以及纳升液体处理技术，每周能够筛选超过100万个样品。² 这项工作的进行很大程度上是得益于rapifleX MALDI-PharmaPulse革命性的10 kHz激光器。

　　实验中可以获得80-400或700-3,500质荷比范围内化合物的质谱图，每个样品只需200次激光照射。在这些实验条件下，该系统在7.36分钟内即可完成1536孔板的检测。按此检测速度计算，要完成200万种化合物的筛选仅需要7.85天。系统稳定性和方法学评估结果显示，108次测量结果具有良好的相关性。

　　由此，他们认为，uHTS的技术和方法是强大的，可以在非常短的分析时间进行大量样品分析。该团队在一周内测量了100多万个样本，并发现即使测量200多万个样本也无需清洗仪器的离子透镜。zui后，他们期待仪器可具有更高通量的筛选能力，期待使用6144孔板也可以达到相近的测试性能。如果采用这种方法，可以将筛查200万个化合物所需的时间缩短到2.39天。

* 小分子药物空间分布研究

　　制药公司越来越意识到了临床研究项目与早期开发工作常常会脱节，为了解决这个问题，ADME/TOX研究尽早与临床研究整合，以便了解还处于临床前阶段的药物分布、代谢和毒理学关键细节。

　　目前确定前体药物及其代谢物组织分布的*方法是整体自显影定量技术（QWBA）和液相色谱-质谱联用技术，但这些方法并不能提供完整的代谢分布图。 QWBA研究成本很高，也不能区分前体药物和代谢产物，在早期药物代谢生化途径和机制研究中有很大的局限性。

　　LC-MS方法则需要从组织匀浆中提取化合物，因此不能得到化合物空间分布信息，更重要的是这种分析方法可能会产生错误的结果。例如，如果代谢物分布在非常小的区域，LC-MS只能报告出组织中的平均含量并不能地表示药物代谢产物的真实分布情况，研究人员可能由此得出药物毒性相关的错误结论。

　　MALDI-MSI方法，可以提供关于药物、药物代谢物和其他内源物质组织的定量和空间分布信息。MALDI-MSI可以帮助研发人员在开始成本高昂的整体自显影定量技术（QWBA）实验之前了解候选药物相关代谢物的空间分布规律及其组织生理学情况，从而决定候选药物是否应该进行下一个研发阶段。

　　MALDI-MSI所采用的一系列质谱仪器类型取决于具体应用需求。例如，MALDI-TOF系统可以提供zui高的通量，而磁共振质谱仪（MALDI-MRMS）可以提供*的质量分辨率和测量准确度。另外，MALDI-MRMS通常可以对成像的化合物进行*的分子式鉴定。

　　在MALDI质谱成像中，常规的新鲜冰冻组织切片用MALDI基质溶液处理，MALDI基质溶液从组织中提取化合物，提取同时可以保留下层组织中化合物的空间分布信息。 MALDI-MSI分析可以生成一组从样品中检测到的化合物的无标记强度/分布图。 MALDI质谱成像不会破坏内部细胞特征，随后可以对样本进行组织学染色，并与MSI图像进行配准分析获得组织病理学信息。

       图1所示的图像说明这种新技术可以为药物ADME / TOX机制的更深入研究提供帮助。Caslino等人³在早期工作中，通过MSI技术以50μm的空间分辨率对3只服用拉帕替尼的狗的肝脏代谢物进行了分析。组织学相关性分析显示分子量为649.14的代谢物特定分布于其炎症部位。

图1.炎症区域特定代谢物的组织学、MALDI质谱成像研究²

  　在同一课题组的文章中4， MALDI-MSI解决了传统LC-MS分析不能解决的问题。研究抗癌药物达拉菲尼对幼年大鼠的肾毒性，在幼鼠肾脏切片中可以观察到管状沉积物，而这些沉积物成年大鼠的肾脏中并不存在。使用MALDI-MSI直接分析管状沉积晶体并确定它们是磷酸钙，这与传统的LC-MS或QWBA相比，可以提供更加完善的评估达拉菲尼的用药风险。

　　结论

　　围绕MALDI-MS建立的新技术和创新方法正在兴起，这有助于更快地发现与筛选候选药物，以及能够在早期以更低成本研究候选药物的ADME / TOX代谢规律。许多制药公司已经充分认识到这些新技术的价值，并采购了的仪器和解决方案。随着相关新应用的不断发布，MALDI-MS技术将在药物早期的发现和研究过程中起到更大的作用。